摘要

  本研究以一株丁酸梭菌菌株为研究对象，以耐受性、抑菌性和粘附性三方面来衡量其益生性。从耐高温、耐胆盐和耐酸方面来评价其耐受性能；从对致病菌的抑制能力来判断其抑菌性；以小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型，探究其是否能定植于肠道。本研究发现丁酸梭菌不仅对常见致病菌K88、K99、O139、O157、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有良好的抑菌效果；而且对产气荚膜梭菌强毒株和弱毒株也有很强的抑制效果，抑菌率分别为89.1%和72.9%。耐受性试验结果也表明丁酸梭菌有很强的耐温、耐酸和耐胆盐的能力。丁酸梭菌在小肠上皮细胞上有较强的粘附性，粘附率为3.4%。本研究证明该株丁酸梭菌益生性能优良，可作为畜禽用微生态制剂开发应用。 

 

  抗生素在饲料添加剂中的广泛使用，引发了一系列公共安全，环境保护和畜禽产品质量方面的问题，导致动物胃肠道菌群失调，产生耐药性和药物残留等（谢树贵2007）。反对在饲料中添加抗生素的呼声越来越高，各国纷纷作出响应。随着农业部194号公告的公布，我国饲料无抗时代也即将来临。饲料中添加抗生素主要针对梭菌、葡萄球菌等革兰氏阳性菌，对大肠杆菌沙门氏菌也有一定的效果。目前抗生素的替代品主要是酶制剂、酸化剂、微生态制剂、中草药、植物精油、植物提取物、溶菌酶和抗菌肽等。丁酸梭菌，又名酪酸梭菌，是存在于人和畜禽肠道的一种厌氧益生菌。丁酸梭菌作为微生态制剂，它能形成内生芽孢，具有耐高温、耐酸、耐胆盐、耐部分抗生素等特性（徐莹2009）。丁酸梭菌体内富含蛋白酶和蛋白酶及脂肪酶，还具有氨基酸载体的作用，能够转运大部分氨基酸，有利于促进动物体生长（赵旭东2011），且对肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌等多种病原微生物有抑制作用（张树波2002）。因此，丁酸梭菌具备抗生素促生长和抑菌作用，同时满足益生菌制剂筛选标准。

1 实验材料

  菌株：丁酸梭菌、产气荚膜梭菌（强毒株）、产气荚膜梭菌（弱毒株）、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O157、大肠杆菌O139、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。
  RCM液体培养基：根据成品培养基说明书称取所需质量培养基溶蒸馏水中，调pH值至7.3±0.1，分装15mL培养基于20mL厌氧管中，121℃灭菌20min。
  RCM固体培养基：根据成品培养基说明书称取所需质量培养基溶蒸馏水中，并加入1.5%琼脂粉，调pH值至7.3±0.1，121℃灭菌20min。
  LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠，溶于1L双蒸水，调pH值至7.3±0.1，121℃灭菌20min。LB固体培养基需另加15g琼脂粉。

2 实验方法
 

2.1 抑菌试验（牛津杯法） 

  （1）指示菌：大肠杆菌K99，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌。

  （2）指示菌菌悬液的准备：指示菌菌种平板划线，37℃培养12h；挑取单菌落于LB肉汤培养基，置37℃振荡培养16h。将培养好的菌液调整到细菌数为1×10⁷ CFU/mL。此时指示菌菌悬液制备完毕。

  （3）丁酸梭菌发酵液准备：菌种平板划线，37℃厌氧培养24h；挑取单菌落于RCM液体培养基中，置37℃厌氧培养48h。将培养好的丁酸梭菌发酵液置于离心机中使用8000r/min转速离心3min，吸取上清液，使用0.22μm无菌过滤器过滤后于4℃冰箱中备用。

  （4）抑菌试验：取100μL 指示菌菌悬液，滴于LB平板上，涂布棒涂布均匀，直至无可见水滴，再用无菌镊子取灭菌牛津杯，轻轻放于LB固体培养基表面，吸取发酵液200μL，注入到放置平稳的牛津杯内（小心加入，切勿滴洒牛津杯之外的培养基上）。再用灭菌陶瓷盖换掉原来的玻璃平皿盖（以吸取培养基在后面实验过程中所蒸腾出的水分）。

  （5）培养：将上述加有上清液的培养基放置4℃冰箱8h，然后再将扩散处理完全后的平皿放入37℃的恒温培养箱内，培养16h-24h后，记录抑菌圈直径。 

  

2.2 丁酸梭菌发酵液与产气荚膜梭菌共培养

  （1）产气荚膜梭菌复苏：菌种平板划线，37℃厌氧培养24h；挑取单菌落于RCM液体培养基中，置37℃振荡培养48h。 

  （2）将活化好的产气荚膜梭菌（强毒株）、产气荚膜梭菌（弱毒株）各1mL分别接入15mL RCM液体培养基中，37℃振荡培养。 

  （3）将活化好的产气荚膜梭菌（强毒株）、产气荚膜梭菌（弱毒株）各1mL分别接入15mL RCM液体培养基中，加入1mL丁酸梭菌处理液作为实验组，对照组中加入1mL RCM液体培养基，于37℃振荡培养。在16h测产气荚膜梭菌活菌数。

2.3 耐受性试验

  2.3.1 耐酸试验 

  称取10g菌粉加入pH分别为1.5、2.5、3.5和4.5的90mL PBS缓冲液中，37℃水浴2h，同时设置对照组。吸取0.5mL菌液于4.5mL灭菌的PBS溶液中梯度稀释，直至得到合适的浓度。涂布于RCM培养基，置于37℃厌氧培养箱内培养48h，观察菌落形态并计数，得出耐受率。 

  2.3.2 耐胆盐试验

  将丁酸梭菌培养两代后，取1mL接种于9mL的含0%、0.1%、0.3%和0.5%胆盐的RCM培养基，37℃静置厌氧培养12h，将培养液10倍连续梯度稀释，直至得到合适的浓度。取0.1mL涂于RCM培养基，置于37℃厌氧培养箱内培养48h，观察菌落形态并计数，得出耐受率。

  2.3.3 耐高温试验

  将摇好的菌液分别放入85℃水浴锅水浴10min，90℃水浴锅水浴5min，拿出立马放入冷水中冷却，同时设置对照组，吸取0.5ml菌液于4.5ml灭菌的PBS溶液中梯度稀释，直至得到合适的浓度。涂布于RCM培养基，置于37℃厌氧培养箱内培养48h，观察菌落形态并计数，得出耐受率。 

2.4 粘附性试验

  （1）IPEC-J2.上皮细胞的培养：将IPEC-J2上皮细胞维持生长于含5%胎牛血清、0.1%青霉素和0.1%链霉素的DMEM/F12培养液中，在37℃、5%CO₂气体条件下培养，隔8日更换培养液。当细胞铺满培养瓶底时用0.25%胰酶-EDTA消化传代。细胞以2×10⁵个的密度接种6孔细胞培养板，培养液成分不加抗生素，粘附试验前12h更换培养液。 

  （2）细菌培养：活化的丁酸梭菌转接RCM液体培养基中厌氧培养24h,离心后用0.01M pH7.2 PBS缓冲液洗涤1次，然后用DMEM/F12基础培养液稀释至10⁶CFU/mL的菌液待用。 

  （3）菌株粘附能力的测定：将培养24h的IPEC-J2上皮细胞用PBS(pH7.2)缓冲液清洗1次，每孔加入10⁶CFU/mL的丁酸梭菌1mL，37℃孵育1h，用PBS缓冲液清洗4次，去除未粘附的细菌,然后每孔加入300μL含0.05% Triton X-100的PBS缓冲液，室温作用10min，用吸管反复吹打以分散细菌，再加入700μLPBS缓冲液以终止反应。10倍系列稀释后进行活菌计数，计算粘附率。

3 结果与讨论

3.1 抑菌试验

  丁酸梭菌具有极强的整肠作用，可以抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的生长（徐莹2009）。丁酸梭菌对常见致病菌抑菌能力结果如图3-1所示，丁酸梭菌对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌O157、大肠杆菌O139、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有很强的抑菌效果。

 

▲图 3-1 丁酸梭菌对常见致病菌的抑菌效果

3.2 丁酸梭菌发酵液与产气荚膜梭菌共培养

  丁酸梭菌发酵液与产气荚膜梭菌共培养试验结果如表3-1和图3-2所示，丁酸梭菌发酵液对产气荚膜梭菌WSSJ01和WSSJ02的抑菌率分别为89.1%和72.9%。表明丁酸梭菌对产气荚膜梭菌有很强的抑制效果。

表3-1 丁酸梭菌对产气荚膜梭菌的抑制作用

菌落数（CFU/mL）	产气荚膜梭菌（WSSJ01）	产气荚膜梭菌（WSSJ02）
对照组	3.4×109	5.9×109
试验组	3.7×108	1.6×109
抑菌率%	89.1	72.9

 

▲图3-2 丁酸梭菌对产气荚膜梭菌的抑菌效果

3.3 丁酸梭菌耐受性

  益生菌用于微生态制剂应考虑其是否能顺利到达肠道及是否能耐受饲料加工（刘燕2006）。由表3-2可知，丁酸梭菌80℃处理10分钟后，存活率为95%，90℃处理5分钟后仍为83%，表明此菌株具有良好的耐热性能，可以耐受饲料熟化和制粒的高温。在pH1.5、2.5、3.5和4.5的条件下处理2h，其存活率分别为98%、98%、98%和99%，表明该菌株具有良好的耐胃酸性能。猪小肠中的胆汁质量分数在0.03%-0.3%范围内波动，而益生菌要到达并定植于猪肠道，必须对胆盐有一定的耐受性。在0.1%、0.3%和0.5%胆盐的条件下处理12h，其存活率分别为99%、96%和97%，几乎不受影响，表明该菌株具有较强的耐胆盐性能。耐受性试验证明丁酸梭菌可顺利通过胃，在肠道中发挥益生作用，并可参与饲料高温制粒。
 

表3-2 丁酸梭菌耐受性能

3.4 丁酸梭菌粘附性 

  丁酸梭菌在IPEC-J2上的粘附率为3.4%，表明其对肠上皮细胞具有较好粘附性，可在肠道顺利定植生长（表3-3）。 

 

表3-3 丁酸梭菌粘附性

  在能发挥抑菌作用的条件下，抵抗pH较低的胃酸环境以及对胆汁的耐受是筛选益生菌的首要指标，本研究发现本菌株在很低pH值胃酸环境下，存活机率很大，有足够多的细菌存活下来，进而顺利到达肠道，而本菌株对肠道胆盐的耐受使其可在宿主肠道中最后顺利定殖并发挥益生作用。另外，益生菌在菌液浓缩或制粒过程中，都要进行高温加热处理，因此，对高温的耐受性成为选择益生菌菌株的另一个关键指标。本菌株会形成芽孢以抵御不良环境，且在80℃条件下10min芽孢存活率在90%以上，这为丁酸梭菌发挥益生作用提供了有利条件。因此，本株丁酸梭菌具有良好的益生性。